Estabelecimento de condições para quantificação de esporos resistentes de por meio PCR quantitativo

Resumo

As hortaliças da família Brassicaceae são cosmopolitas sendo a Região Serrana do Estado do Rio de Janeiro uma das maiores produtoras de brássicas do país. A região, atualmente, passa por um grave problema fitossanitário causado pelo protozoário Plasmodiophora brassicae, causador da hérnia das crucíferas, que propicia a formação de galhas irregulares no sistema radicular, causando, subdesenvolvimento e perda na produtividade. O presente trabalho visa empregar a metodologia de PCR quantitativa (qPCR) para realizar o mapeamento de áreas de produção de crucíferas com e sem a infestação do P. brassicae e, consequentemente, definir áreas com potencial de uso e com menor risco econômico e/ou indicação de práticas de manejo. Inicialmente foi necessário a extração de esporos de P. brassicae a partir de raízes contendo galhas de plantas de couve-flor acometidas com a doença. Estes esporos foram utilizados na extração de DNA total e utilizados como molde em PCRs convencional e quantitativa.  Foram empregados 3 pares de iniciadores que anelam especificamente no gene 18S rDNA de P. brassicae. Uma etapa importante para a execução das qPCRs quando a mesma envolve a quantificação absoluta é a construção de uma curva padrão e, para isso, será necessária a clonagem de fragmento do gene 18S rDNA, a ser empregado como molde. Os resultados parciais mostraram a presença de DNA em quantidade e com qualidade nas amostras de P. brassicae para serem utilizadas nas reações de PCR. Também foi possível validar os iniciadores testados a partir da amplificação de fragmentos de 548 pb, 519 pb e 103 pb nas reações de PCR. Entretanto, ainda não foram obtidos clones contendo o fragmento do gene 18S rDNA de P. brassicae para construção da curva padrão e, com isso, dar início a coleta do solo em áreas produtoras e as análises de qPCR.